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一文與您分享熒光定量PCR試劑盒的設計原理
點擊次數:876 更新時間:2023-05-26
   熒光定量PCR(Real-time PCR)技術是一種能夠實現快速、精確、靈敏檢測的分子生物學方法。其原理是在PCR反應過程中同時監測靶基因擴增產物數量的動態變化,從而推算出樣本中對應靶基因初始含量的一種手段。
 
  熒光定量PCR試劑盒是熒光定量PCR技術的重要組成部分,在熒光定量PCR實驗中起著至關重要的作用。熒光定量PCR試劑盒通常包括模板DNA、引物(Forward和Reverse)以及探針(Probe)、酶(如Taq DNA聚合酶)、熒光染料等多種組分,這些試劑分別發揮不同作用協同完成PCR反應。
 
  熒光定量PCR試劑盒中的引物和探針的設計與選擇具有很高的專業性和針對性,在針對不同的目的和實驗設計情況下具有各自優劣。引物序列需要與所需擴增的靶基因區域匹配,引物都有向前和向后兩個方向,以保證對兩側位于核苷酸互補鏈上的DNA序列進行擴增。而探針則要求與引物具有一定的覆蓋長度,其序列應優化至適合搭配引物并兼顧熒光特性和檢測靈敏度。目前常用的探針是TaqMan探針、MGB探針和MolecularB beacon等。
 
  同時,在PCR反應的早期,反應產生非特異性PCR產物,這些產品通過DNA雙鏈發生耦合阻礙擴增產物的累積,嚴重影響了PCR檢測結果的準確性。為此,熒光定量PCR試劑盒需要添加Uracil-DNA聚合酶(UDG)和dUTP將殘余外源DNA分解,降低污染以及所得PCR擴增產物的假陽性率,提高PCR實驗的穩定性和準確度。
 
  除此之外,熒光定量PCR試劑盒增加熒光染料和探測器以實現實時監控和定量 PCR 反應,它能夠不斷進行獲取數據,在PCR過程中計算核酸擴增本原數量,并在實時顯示屏幕上展示出制品的表達大小。因此,熒光定量PCR技術廣泛應用于基因分型和基因定量以及細胞凋亡等相關研究。
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